Mescidin girişinde, kıble tarafındaki duvarında bulunmaktadır. Renkli mermerlerle kaplıdır. Mihrabın üst kısmına sülüs hattıyla kuran ayetleri kabartmalı olarak yazılmıştır. Son derece güzel görünür. Ömer bin Abdülaziz, mescidi şerifin genişletilmesinden sonra Hz. Osman (ra)’ın namaz kıldığı yere bu mihrabı yapmıştır. Eşrefül melik Kayıtbay tarafından hicri 888 yılında yenilenmiştir. Günümüzde imamlar burada hala namaz kıldırmaktadır. Mihrabın sağ en üst köşesinde Sultan 1. Abdülhamid’in hicri 1198/ miladi 1783 yılında mescidi nebeviye hediye ettiği kare mermer levha göze çarpmaktadır. Sağ en üstte bulunan Hz. Osman Mihrabının tacı olan levhada güzel bir kufi hattıyla şu ayeti kerime yazılıdır: “لَقَدْ جَٓاءَكُمْ رَسُولٌ مِنْ اَنْفُسِكُمْ عَزٖيزٌؗ عَلَيْهِ مَا عَنِتُّمْ حَرٖيصٌ عَلَيْكُمْ بِالْمُؤْمِنٖينَ رَؤُ۫فٌ رَحٖيمٌ” Öbür köşede ise yine Sultan 1. Abdülhamid’in hicri 1198/ miladi 1783 yılında mescidi nebeviye hediye ettiği kare mermer levha bulunmaktadır. Hz. Osman Mihrabının tacı olan levhada güzel bir kufi hattıyla şu ayeti kerime yazılıdır: “مَا كَانَ مُحَمَّدٌ اَبَٓا اَحَدٍ مِنْ رِجَالِكُمْ وَلٰكِنْ رَسُولَ اللّٰهِ وَخَاتَمَ النَّبِيّٖنَؕ وَكَانَ اللّٰهُ بِكُلِّ شَيْءٍ عَلٖيما”
